光学上有种丁达尔现象:细微颗粒在强光的直射下,不能为人眼所见,这是因为光线过强及绕射现象等因素所造成;把光线斜射,风由于光的强烈反射或衍射结果,细微颗粒似乎增大了体枳而被人眼所见。这就像平常室内本有许多灰尘飞扬,可我们看不见,但在暗的房内有一束光线(太阳光或强烈的灯光)从门狭缝中斜射进来,微尘就可见了,所谓暗视野照明就是类似情况。
暗视野显微镜能观察到在通常明场视野下看不到的微细物体,其分辨率可为0.2~0.004 um,因此暗视野显微术也可称“超显微术”。暗视野显微镜与明视场显微镜结构上的不同主要在于聚光镜,并且其物镜的NA值一般也较小,这样是为了使照明的光线不直接进入物镜,而造成了暗视野。强大的光线照射在标本上,标本遇光线发生反射或散射(衍射),散射的光投入物镜内,而被人所观察。由于是利用被检物体的表面散射光来观察物体,所以通常情况只能看到物体的存在和运动,而看不清物体的细微结构(非均质或加方位光阑等情况除外)。暗视野聚光镜种类很多,生物学上常用的是抛物面暗场聚光镜,还有心形面聚光镜,明暗两用聚光镜、辉光聚光镜、同心球面聚光镜。
暗视野显微镜在镜检中,最忌载玻片、盖玻片不洁或有疵痕,这样会造成乱反射干扰。载玻片厚应在0.7~1.7 mm内,另外,无论干燥系或油浸系物镜,镜检时应在聚光器和载玻片之间加一滴香柏油,以免光线全反射而不能到达被检物体上,物镜与盖玻片之间不能放油,否则会变成明视场。此外,物镜NA值选用不合适也会变成明视野,NA值应为1以下,聚光器,物镜,目镜的光轴也需严格地在一直线上,并选用强光源作照明。